Das Nationalmuseum, eine wissenschaftliche Institution, die historische und naturwissenschaftliche Sammlungen systematisch aufbereitet und ausstellt, wurde dank der Bemühungen vieler hervorragender Persönlichkeiten in Böhmen bereits am Ende des 18. Jahrhundert gegründet. Besondere Anerkennung solcher Bemühungen gehört Kaspar Maria Graf Sternberg, den man zu den Hauptbegründern des Nationalmuseums zählen muss. Auch unter der aufgeklärten Aristokratie und den patriotischen tschechischen Politikern fanden die Vorschläge von Kaspar Sternberg Anklang, besonders bei dem Obersten Burggrafen Franz Liebsteinsky von Kolowrat. Die öffentliche Erklärung von der Gründerversammlung am 15. April 1818 kann als Gründungsurkunde des Nationalmuseums betrachtet werden.
Anfangs waren die Sammlungen in verschiedenen Räumlichkeiten über ganz Prag verstreut. Erst 1819 erhielt das Museum einen ständigen Raum im Sternberg-Palais auf der Burg. Nach einem Vierteljahrhundert, 1846, wurde es ins verhältnismäßig kleine Nostitz-Palais in Na Prikope, umquartiert.
Heute hat das Museum in zehn Gebäuden etwa 14 Millionen Gegenstände aus den Gebieten Naturgeschichte, Geschichte, Kunst, Musik und Bibliothekswesen unter seinem Dach. Während des ganzen Jahres werden den Besuchern etliche ständige Ausstellungen geboten, aber auch wechselnde zeitlich begrenzte Ausstellungen. Diese sind im allgemeinen in der Hollareum Ausstellungshalle im Erdgeschoss des Hauptgebäudes zu finden, aber auch auf den zwei Fluren, die zum Eingangsvestibül führen. Kleine Ausstellungen über Buchkultur findet man auch im Erdgeschoss vor dem Eingang zum Leseraum der Nationalmuseums-Bibliothek. Im ersten Stock gibt es gegenüber dem Pantheon drei Räume, wo ebenfalls zeitweise Ausstellungen stattfinden. Räumlich weniger anspruchsvolle Ausstellungen werden manchmal auch auf der Galerie im zweiten Stock präsentiert, während im Pantheon selbst regelmäßig Ausstellungen von besonderer Bedeutung stattfinden. Das Pantheon wird manchmal für außergewöhnliche gesellschaftliche Abendereignisse benutzt. Die Aufgangstreppe des Nationalmuseums hat eine besonders gute Akustik und wird deshalb traditionell oft zum Schauplatz von Kammer- oder Chor-Konzerten.